一、大腸桿菌  

細菌是單細胞的原核生物。細菌細胞的結(jié)構(gòu)有細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)等。細菌無成型的細胞核，細胞壁由肽聚糖組成。由于細菌細胞壁結(jié)構(gòu)不同，細菌可分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩類。革蘭氏陽性菌細胞壁厚，無莢膜，多產(chǎn)生外毒素；革蘭氏陰性菌細胞壁薄，有莢膜，多產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭氏陽性菌對青霉素更為敏感。  

大腸桿菌是革蘭氏陰性、異養(yǎng)兼性厭氧型腸道桿菌。在腸道中一般對人無害，但任何大腸桿菌進入人的泌尿系統(tǒng)，都會對人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌在基因工程技術(shù)中被廣泛的應用，它的質(zhì)粒是常用的運載體，它也是基因工程中常用的受體細胞。  

二、培養(yǎng)基配置  

微生物生命活動過程中需要的化合物有碳源、氮源、生長因子、無機鹽和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生長因子是微生物生長*的微量有機物，但不一定需要外界補充，有的微生物可以自身合成。在提供上述幾種主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。  

我們一般用LB液體培養(yǎng)基來擴大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離。以下為本實驗中培養(yǎng)基配置步驟：  

1．稱量：準確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時還需加1g瓊脂。  

2．溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時還需加瓊脂，整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。  

3．調(diào)pH：用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。  

4．滅菌：在兩個250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養(yǎng)基和50ml LB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1kg壓力滅菌15min。  

5．倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。其過程是：  

①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；  

②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；  

③用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；  

④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。  

倒過來放置的目的是防止培養(yǎng)基冷卻過程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。向培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移已滅菌的培養(yǎng)基時，也不要把培養(yǎng)基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會在這些粘附培養(yǎng)基上繁殖，并污染皿內(nèi)培養(yǎng)基。  

三、滅菌和消毒  

1．無菌技術(shù)：  

①對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；  

②將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌；  

③為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰旁進行；  

④避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。  

2．消毒方法：  

①日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；  

②對一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；  

③對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強消毒效果，然后使用紫外線進行物理消毒；  

④實驗操作者的雙手使用酒精進行消毒。  

3．滅菌方法：  

①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；  

②培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；  

③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。  

4．比較消毒和滅菌：  

比較項         理化因素的作用強度 消滅微生物的數(shù)量 芽孢和孢子能否被消滅  

消毒         較為溫和         部分生活狀態(tài)的微生物         不能  

滅菌         強烈         全部微生物         能  

5．注意事項：  

①實驗中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在60～80℃烘箱中除去滅菌時的水分；  

②物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi)冷空氣，其目的是有利于鍋內(nèi)溫度升高，隨后關(guān)閉排  

氣閥繼續(xù)加熱，加熱結(jié)束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務必降至零時打開鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸；  

③在用任何器皿轉(zhuǎn)接時，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺面上，接種時要在酒精燈火焰旁操作；  

④培養(yǎng)基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養(yǎng)皿壁上，否則容易污染；  

⑤接種時要膽大心細，動作快捷，這是減少污染的關(guān)鍵；  

⑥接種后，培養(yǎng)皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養(yǎng)箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養(yǎng)基表面，  

水流擴散會使菌落擴散，就很難形成單菌落了。  

四、細菌的分離  

1．劃線分離法：用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少。劃線到后，可使細菌間的距離加大。在培養(yǎng)10～20h后，可由一個細菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產(chǎn)生的后代。  

其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。  

取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；后灼燒接種環(huán)的目的是防止細菌污染環(huán)境和操作者。  

2．涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋到10－5 ～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進行培養(yǎng)，在適當?shù)南♂尪认拢僧a(chǎn)生相互分開的菌落。通常每個培養(yǎng)皿有20個以內(nèi)的單菌落為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養(yǎng)后，再做功能性實驗。  

劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復雜些。細菌的兩種分離法各有優(yōu)點,都可采用。  

五、菌落和菌種種類的辨認  

單個細菌用肉眼是看不見的，但是，當單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，便會形成一個肉眼可見的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。不同種類的細菌所形成的菌落在大小、形狀、顏色、光澤度、透明度等方面具有一定的特征。  

細菌的菌落表面一般是光滑而濕潤的，有黏稠性，多數(shù)透明或半透明，但也有細菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細的菌絲并可產(chǎn)生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅實多皺，長孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動；酵母菌落類似于細菌菌落，表面光滑而濕潤，有黏稠性但大多呈乳白色，少數(shù)呈紅色。  

如果菌落無法辨認，只有借助于顯微鏡觀察。在顯微鏡下細菌一般為桿狀、球狀和弧狀，直徑都在1um左右；放線菌菌絲是沒有橫隔的分枝絲狀體，氣生菌絲頂端分裂成串狀孢子，孢子絲有直線形、螺旋狀、彎曲式或輪生等；酵母有卵圓型或絲狀，但卵圓形細胞大于細菌，直徑約5~7um。